哪些軟體可用於引物設計？ 有什麼優點和缺點？

優點和缺點如下：

1.軟體設計。

另外，引物的設計、PCR擴增很大程度上與擴增的酶有關，尤其是具有特殊結構的片段，GC含量過高或過低，都會導致擴增效率下降，需要選擇合適的酶。 不用說，歐美的酶品牌肯定要好一些，有些品牌的酶也可以稀釋到30%，增加普通碎片。

2.手工設計。

遇到軟體設計做不到，或者需要放大全長的時候，只能手工設計，有經驗的人可以粗略看一下就知道該選哪一段了。

注意：1.不要糾結於退火溫度，計算方法不同，退火溫度也不同，只要差不多，一般在55-65度之間。 對於同一對巨集觀棚，我也遇到了非常好的55-65度放大倍率。

所以，以後不要問底漆退火溫度，這不是乙個值得討論的問題。

2、mRNA的螢光定量引物設計，正向引物設計在編碼區的尾部，反向引物設計在尾端附近的非編碼區，使DNA無法擴增，擴增的為mRNA。

設計手動慢冰雹底漆的優缺點如下：快速、自動化。 缺點：設計完成後，需要對虛擬帆進行人工分析作為補充。 網頁設計通過特定的網頁直接獲取設計的引物。

正向底漆，反向底漆。

引物本身和引物損失之間不應有互補序列。 應少於 4 個連續互補鹼基。 引物的g值不宜高，g值越高，雙鏈越穩定。

引物長度和GC含量應適中。 引物長度約為18-28 bp，但不應大於38 bp，引物太短會影響擴增的特異性，如果太長，延伸溫度將大於74，不利於Taq酶的催化反應。 如果擴增產物為4 5 kb，則引物應不小於24 bp。

至於引物的設計，一般原則如下：

序列選擇應在基因的保守片段中。

避免引物本身或與引物形成4對或更多連續對，避免引物本身形成環形髮夾結構。

典型的引物長度為 18 至 24 個核苷。 引物需要足夠長，以保證序列的唯一性，並降低序列存在於非靶序列位點的可能性。 但長度超過 24 個核苷的引物並不意味著更高的特異性。

較長的序列可能會與錯配對的序列雜交，從而降低特異性，並且比短序列雜交慢，從而導致產量降低。

TM值為55-65（因為60核酸外切酶活性最高），GC含量在40%-60%之間。

避免引物之間的 TM 差異超過 2

避免在引物的 3' 端使用鹼基 A，在引物的 3' 端使用 3 個或更多連續相同的鹼基。

為避免擴增，引物設計最好跨兩個外顯子。

TaqMan 探針 PCR 需要 80 bp 至 150 bp 的片段長度

引物末端（最後 5 個核苷酸）不能超過 2 g 和 c。

引物是一小塊單鏈 DNA 或 RNA，可作為 DNA 複製的起點，並允許 DNA 聚合酶從引物的 3' 端附著脫氧核苷酸。 （DNA聚合酶只能從3'端延伸DNA鏈）。 引物包括來自自然界生物體的 DNA 複製引物（RNA 引物）和通過聚合酶鏈反應 （PCR） 合成的引物（通常為 DNA 引物）。

一般來說，引物是指DNA引物。

引物由兩種合成化合物合成，通常由15-30個核苷酸組成，由3,5-磷酸二酯鍵連線。 乙個引物與DNA模板鏈的一端互補，另乙個引物與另一條模板鏈的另一端互補。

在引物的設計中有一些基本原則，如引物的GC含量為40%60%，熔融溫度最好接近72度，鹼基應隨機分布，引物之間不能有互補序列等，除了專門的計算機軟體外，還有專門的公司的特殊設計人員可以承擔這項工作。

最簡單的方法是在你感興趣的序列的頭部取大約 20 nt 和尾部大約 20 nt。 請注意，GC 含量大致相同。

對於更專業的，您可以使用軟體設計，例如向量 nti

它們中的大多數都是您的目的剪輯的一部分。 設計時需要注意的方面很多，都是網上介紹的，但需要注意的是，他所說的20個左右的鹼基，並不包括酶切割位點和保護鹼基的數量。

1.引物的長度一般為15-30 bp，常用的長度為18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其伸長溫度大於74，不適合Taq DNA聚合酶反應。

2.引物序列在模板中不宜具有較高的相似度，尤其是3'端相似度高的序列，否則容易導致錯配。 引物 3' 端存在 3 個以上的連續鹼基，例如 GGG 或 CCC，也會增加錯誤觸發的機會。

3.引物3'端的最後乙個鹼基對Taq酶的DNA合成效率有很大影響。 不同的末鹼基導致錯配位置的擴增效率不同，且末鹼基A的失配效率明顯高於其他3個鹼基，因此應避免引物3'端的鹼基A。

引物應至少超出限制性內切酶識別位點的 3 個核苷酸。

避免二聚體和自互補：引物的設計需要避免二聚體的形成或兩種引物之間的自互補，從而影響PCR效率和特異性。 執行特定測試：

使用軟體工具進行特異性檢測，以確保所選引物僅擴增靶DNA序列，而不擴增其他非特異性DNA。

與引物對應的模板序列的TM值應在72左右。 tm 值約為 72 可以使復性條件達到最佳狀態，至少在 55-80 之間。

引物的長度一般為15-30 bp，常用的長度為18-27 bp，但不應大於38，因為太長會導致其延伸到魯河子溫度大於74，不適合TaqDNA聚合酶反應。