在哪裡可以完整地了解螢光PCR？ 緊急！！！

是實時螢光定量PCR嗎，我有課件發給大家看？

螢光PCR是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光訊號積累實時監測整個PCR過程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量的方法。 它也被稱為實時螢光定量PCR。

螢光-PCR技術原理：將螢光素標記的TaqMan探針與模板DNA混合後，完成高溫變性、低溫復性、公升溫延伸的熱迴圈，遵守聚合酶鏈式反應規律，切斷與模板DNA互補的TaqMan探針，反應體系中游離螢光素。

螢光在特定光激發下，隨著迴圈次數的增加，擴增的靶基因片段呈指數級增加，通過實時檢測相應的螢光訊號強度並進行擴增，得到Ct值，同時以幾種已知模板濃度的標準品為對照，可得到待測標本靶基因的拷貝數。

一種使用螢光化學品測量 DNA 擴增反應中每個聚合酶鏈反應 （PCR） 後產物總量的方法。 一種通過內部或外部對照對待測試樣品中特定DNA序列進行定量的方法。

實時螢光定量PCR是在PCR擴增過程中通過螢光訊號對PCR過程進行實時檢測。 由於在PCR擴增的指數期內，模板的CT值與模板的起始拷貝數之間存在關係，因此成為定量的基礎。

技術原理。 將螢光素標記的TaqMan探針與模板DNA混合後，完成高溫變性、低溫復性、適溫延伸的熱迴圈，觀察具有聚合酶鏈除顫閉合律的TaqMan探針，切斷具有模板DNA互補對的TaqMan探針，螢光素在反應散射罩系統中游離。

螢光在特定光激發下，隨著迴圈次數的增加，擴增的靶基因片段呈指數級增加，通過實時檢測相應的螢光訊號強度並進行擴增，得到Ct值，同時以幾種已知模板濃度的標準品為對照，可得到待測標本靶基因的拷貝數。

德國DBI牌螢光試劑的說明書非常明確。

BioGHC EliteFast SYBR 預混液含有 DNTP MIX、Mg2+、SYBR Green I 和 BioG 熱啟動聚合酶，一般來說，反應體系中的最終引物濃度可以獲得良好的擴增效果，當反應結果不理想時，可以在範圍內調節引物濃度。 qPCR反應靈敏度高，模板量的準確性對結果影響很大，因此建議適度稀釋後加入模板，或使用50ul反應體系。 模板體積不應超過反應體積的10%，操作時避免強光照射，擴增產物長度應在100bp-500bp範圍內，反應條件：

95 加熱 6-10 分鐘以啟用熱啟動 DNA 聚合酶，然後加熱 95 加熱 5-15 秒，加熱 60 加熱 30-35 秒，持續 40 個迴圈。 反應條件可根據目標片段的大小、引物的TM值等進行調整。

影響螢光PCR的因素有很多，但從操作和技術角度來看，有幾點需要注意：

RNA完整性。

這是因為一旦RNA降解，定量結果就不能正確反映樣品中mRNA的量，得到的結果也是錯誤的。 因此，在RNA提取過程中，必須嚴格遵循操作規範，避免被RNA酶汙染。

RNA樣本中的基因組DNA汙染。

提取的RNA樣品不可避免地含有少量的基因組DNA。 基因組DNA對實驗有兩個影響：一是影響RNA的精確定量; 二是影響PCR擴增的特異性。

優化PCR反應體系。

PCR擴增過程必須保證擴增產物只有特定的靶產物，為此，必須首先優化PCR反應體系。 目前，許多公司都有實時螢光定量PCR反應試劑盒，可以方便PCR反應的操作。

反轉錄。 通過逆轉錄獲得的cDNA量必須與相應mRNA的量完全相等，而逆轉錄是實時螢光定量PCR的關鍵步驟。 目前常用的逆轉錄酶有兩種型別：

AMV-RT 和 MMLV-R。 通常用於逆轉錄的引物有隨機引物、oligo-dt 和特異性引物。 相比之下，Oligo-DT和特異性引物更適合實時螢光定量PCR。

5.使用實時螢光定量PCR研究基因表達時，必須使用內標基因進行相對定量。 可靠的內標基因應該是在不同細胞型別和不同測試條件下穩定表達的管家基因。

常用的內標基因有-tublin、肌動蛋白、

GAPDH、18SRNA、EFLA 和 Cyclophilin 等。 雖然在大多數情況下，這些管家基因的表達非常穩定，但是。

最近，有報道稱，這些管家基因的表達在某些情況下會發生變化。 也就是說，並非所有內標基因都適合。

任何試驗。 在選擇內標基因時，應慎重考慮多種因素，選擇合適的內標基因或內標基因組合。

使用2-CT方法應該如何計算？

假設檢測到基因 A，則 CT 是（請記住，CT 越大，相對含量越低）共同組檢驗1：28

實驗組 1 test2：29

實驗組 2 test3：30

這時候就需要設定乙個對照組了，假設test1是對照組（普通組），當然普通組就是對照組。

那麼，相對內容是：

正常組測試1：1

實驗組 1 test2：2 -（28-29）=1 2=實驗組 2 test3：2 -（28-30）=1 4=實驗組 1 和實驗組 2 基因 a 的表達分別下降了 2 倍和 4 倍！

所以，結果出來了。

對於每組不同的零件，是否可以將其中乙個零件與 1 進行比較？

如實驗組1睪丸

brainliver

muscle

您可以使用其中任何乙個作為 1 作為比較，但您必須在圖中的圖例中指出它，並且要說清楚！

如果比較三組的同一部分，是否也應該將其中乙個組視為 1？

是的，你可以，例如。

腦，正常組，測試1

實驗組 1 test2

實驗組 2 test3

以普通組test1為對照組，設定為1，其他為相對內容，圖中也要註明清楚！

這個很簡單。 將正常組的一部分的相對量設定為 1。 其他人，無論是在組內還是在組間，都使用 CT 來計算相對量。

讓我們來比較一下。 基本思想是以乙個點為基礎，其他點是相對的。 不要每次都設定 1。