RNA分離試劑盒的製作、RNA提取方法和原理

RNA提取通常使用Trizol方法完成

Trizol 是一種總 RNA 提取試劑，含有異硫氰酸胍等物質，可快速裂解細胞並抑制細胞釋放的核酸酶活性。 目前，Trizol法常用於從組織或細胞中提取RNA。

trizol的工作原理：

在勻漿或溶解的樣品中，Trizol® 試劑可保持 RNA 完整性，同時破壞細胞和裂解細胞成分。 氯仿離心後，裂解物分為水相和有機相。 RNA存在於水相中。

水相轉移後，RNA被異丙醇**沉澱。 除去水相後，可用乙醇從中間相析出DNA，加入異丙醇沉澱可從有機相中得到蛋白質。

目前的提取套件都配有配套的說明手冊，如果需要，我可以單獨傳送給您。

以下是Biodai離心需要製備的材料：無水乙醇、生理鹽水、1M NaOH、無RNase離心管。

1.除去沉澱物並洗滌溶液，然後按以下步驟操作：

a）沉澱：加入無水乙醇;將 9 ml 加入 51 ml 無水乙醇中。

b）洗滌液：9ml加入21ml無水乙醇;加入18ml至42ml無水乙醇中。

c）如果製備的沉澱物中有沉澱物，則可溶於37中並搖勻。

2.樣品處理： a） 拭子：

向無RNase離心管中加入800L生理鹽水，將拭子收集的樣品置於生理鹽水中，洗滌20秒以完全分離細胞，粘在離心管壁上並擠出拭子上的液體，以12,000rpm離心5分鐘，棄去700L上清液， 和剩餘的100L上清液，充分振盪攪拌均勻。

b） 痰液：向收集的痰液中加入 4 倍體積的 1 M NaOH，室溫放置 30 分鐘，每 10 分鐘搖勻混合一次，以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，棄去上清液，加入生理鹽水，充分混合，以 12,000 rpm 離心 5 分鐘，棄去 400 L 上清液，剩餘 100 L 上清液， 充分搖晃並混合。

3.加入 200 公升裂解物和 20 公升消化液，振盪和 56 水浴混合 10 分鐘。

4.加入沉澱物500L，輕輕倒置混勻，若有半透明懸浮液，則不影響RNA提取及後續實驗。

5.將吸附柱放入收集管中，將上述溶液吸入吸附柱中，靜置2 min，以12000 rpm離心4 1 min，棄去收集管內的廢液。

6.將吸附塔置於**集管中，向吸附塔中加入500 l洗滌液，以12000rpm離心4 min，棄去收集管內的廢液。

7.將吸附柱置於**集管中，以12,000rpm離心4 2 min，除去殘留的洗滌液。

8.取出吸附柱，放入新的ml離心管中，加入30-50L洗脫液，靜置3分鐘，以12,000rpm離心42分鐘，收集RNA溶液。

9.-70 次儲存，或直接用於下乙個實驗。

每個套件都有使用說明書，說明如下。

夥計：不知道你用什麼來提取？

提取不同的專案是不同的。

氯仿是一種分子量比較大的有機溶劑，在提取RNA時可以有效地製備有機相。

無機相被快速分離。 DNA提取工藝 有機相主要由酚類和蛋白質組成，它們使蛋白質和DNA分離並進入水相。 但是，在RNA提取過程中，必須避免蛋白質和DNA的分離，否則DNA會釋放到水相中。

不管有沒有苯酚，氯仿本身對蛋白質也有變性作用，容易使DNA的親水基團與水接觸。 所以不要太激烈**。

異丙醇的作用是通過-OH的疏水作用保護RNA或DNA鏈中的親水基團，相當於沉澱，但這種反應發生在水相中，與先前的氯仿並不矛盾。

氯仿的作用有很多方面，一是使蛋白質作為有機溶劑變性，通過離心析出並除去，同時通過變性抑制RNA活性; 其次，RNA提取試劑通常含有苯酚（Trizol的主要成分是苯酚，許多製備試劑的方法也使用苯酚，提取蛋白質時也會使用苯酚），苯酚微溶於水，提取烷烴後水相中有微量苯酚，如果不除去， 核酸會被破壞，水相中涉及的苯酚需要通過氯仿提取;第三，用作溶劑，提取樣品中的一些脂溶性雜質（如油類、脂溶性顏料等），對去除雜質起一定的作用。

通常在氯仿中加入少量異戊醇（1 25），以減少蛋白質在變性過程中因**而產生的泡沫，這會影響後續操作，但個人經驗覺得加不加沒有太大區別，可能我的樣品中蛋白質不多。

異丙醇用於沉澱核酸，作用與乙醇相同。 只是用量少了一點，就夠了，不像乙醇沉澱，至少需要2V，一般需要加倍的體積。 當水相較多時，離心管容積有限，可加入過多乙醇，一般採用異丙醇沉澱。

但是，我覺得效果不如乙醇，偶爾會有東西不能沉澱的時候。

Trizol是裂解細胞，氯仿是提取RNA，異丙醇沉澱RNA，最後用酒精清洗，在上層提取過程中可能會引入雜質，也可能在操作過程中引入雜質。

Trizol的主要物質是異硫氰酸胍，它破壞細胞，使RNA釋放，同時保護RNA的完整性。 加入氯仿離心後，將樣品分為水層和有機層。 RNA存在於水層中。

收集上層水樣後，可通過異丙醇沉澱還原RNA。 除去水層後，樣品中的DNA和蛋白質也可以通過沉澱還原。 乙醇沉澱可以從中間層沉澱DNA，在有機層中加入異丙醇可以沉澱蛋白質。

我剛才提到的RNA，這是我寫的程式。

1.無RNase滅菌水DPC水：用蒸餾水在玻璃瓶（180 2h）中高溫烘烤，然後加入DEPC（體積體積），處理過夜，然後高壓滅菌。

DEPC水：

浸泡實驗器皿用DEPC水的製備：在1000ml雙蒸水中加入1ml DEPC中，放入1000ml容量瓶中靜置4小時後靜置。

用75乙醇配製DEPC水：100ml鹽水瓶中裝滿40ml雙蒸水，加入40ul DEPC，37過夜，高壓送去。

乙醇：用DEPC處理過的水（在可高壓滅菌的容器中製備）製備75%乙醇，然後儲存在高溫烘烤的玻璃瓶中的低溫冰箱中。

製備75%乙醇。

乙份無菌、無酶的水與3份（體積）的無水乙醇混合。 3.無水乙醇。

4.氯仿（最好是新的）。

5.異戊醇（優選新品）。

我平時買的是trizol試劑，我真的沒配過。

除Trizol外，還需要氯仿，異丙醇，乙醇，depc處理水