哪種轉染試劑更適合 293T 細胞

許多真核表達載體，例如含有SV40病毒複製起始位點的真核表達載體，可以在表達SV40病毒T抗原的細胞系中複製，從而增加外源基因的表達水平。 293T細胞是表達SV40病毒T抗原的細胞系，是**人胚胎腎細胞293HEK，修飾後將T抗原插入其中，因此轉染293T細胞可以獲得更高的表達水平。 293T細胞也可作為常見的哺乳動物細胞來篩選穩定表達的細胞系，但由於粘附性差，容易脫落，不利於篩選。

3T3細胞是小鼠胚胎成纖維細胞系，具有顯著的接觸抑制作用，易於識別轉化細胞。

293T是人腎上皮細胞，我個人認為轉染難度大; 3T3是脂肪細胞，分為幾種型別，NIH3T3更好，3T3L1更難轉動。

對於難轉染的細胞，我在網上看到了一款價效比高的RFECT小核酸轉染試劑，它使用奈米材料使siRNA更容易轉移到細胞中，對難轉染細胞的轉染陽性率很高。 我試過幾種難以轉染的細胞系，效果還可以，普通細胞轉染沒有問題。

隨著丙酮酸的加入，生長加速。

如果你不加長它也很好。

大多數人目前正在使用lipofectamin 2000！！ 該試劑的轉染效果比較好，特別是病毒包裝時，需要三個質粒，因此對轉染試劑的要求較高。

來自使用者的內容：xieexin

細胞轉染實驗 1 實驗目的。

學習並掌握將外源基因引入真核細胞的主要方法——脂質體介導的轉染。 了解外源基因輸入的一般方法，觀察外源蛋白（綠色螢光蛋白）的表達，準備染色實驗材料。

2 實驗原理。

transfect

上圖是脂質介導的轉染示意圖，顯示了外源質粒進入細胞的一般過程。 外源基因進入細胞的方法主要有四種：電擊、磷酸鈣、脂質體介導和病毒介導。

電擊法是細胞的短期臨時穿孔，以允許外源質粒進入; 磷酸鈣法和脂質體法利用不同的載體物質攜帶質粒，使外源基因通過直接膜穿透或膜融合進入細胞; 病毒法是一種用病毒感染細胞的方法，這些病毒包裝外來基因，使它們可以進入細胞。 但是，由於電擊法和磷酸鈣法的實驗條件受到嚴格控制，難度較大。 病毒法的前期製備比較複雜

它可能對細胞產生很大影響; 因此，對於許多常見的細胞系，一般的瞬時轉染方法多為脂質法。 因此，脂質體與質粒的比例、細胞密度、轉染時間的長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題。

上圖是本實驗中使用的脂質體中陽離子組分結構的示意圖。 本實驗中使用的脂質體是 Promega 的 TransFast 脂質體試劑，它是陽離子脂質體和中性脂質體的混合物，針對本實驗中使用的 293T 細胞的轉染進行了優化。

3.實驗材料及裝置： 1）材料：293T細胞中的MYOD表達質粒和EGFP表達質粒D

血清的存在會干擾siRNA與轉染試劑的混合，從而影響轉染效率。 用於稀釋 siRNA 和稀釋轉染試劑的推薦培養基為無血清培養基。 在我們實驗室的前部，我們剛剛完成使用rfect和siRNA方法製備A549細胞，細胞的鋪板密度約為45%，siRNA的最終濃度設定為10 nm、30 nm、50 nm和100 nm，在24孔板中，每個梯度製作2個雙孔，以方便比較。

這是轉染試劑的問題，毒性稍大，導致細胞死亡，所以不要使用無血清培養基，直接使用不含雙特異性抗體的完整培養基，或者嘗試rfect srna轉染試劑，轉染後不能改變培養基，對細胞的毒性較小。

如果 293T 本身不表達這種蛋白，則很可能是一抗的質量達不到標準。

你可以做乙個蛋白質印跡來看看。 免疫組化假陽性大多正常（非特異性吸附）。

蛋白質印跡是通過分子量來判斷的，這很難偽造。

脂質體的轉染毒性最大，很明顯，如此多的細胞死亡是由於轉染的細胞毒性造成的。 對此我有兩個建議，乙個是減少DNA的量，我平時都是做轉染的，對於任何細胞，只要是12孔板，我平時用1ug的DNA，這個量絕對夠用。 因為質粒轉染到細胞中的性質，與病毒感染沒有什麼不同，質粒的各種元件會從宿主細胞中搶走大量的細胞機器，開始轉錄和翻譯你的靶蛋白，並在此過程中產生大量未正確摺疊的蛋白， 而這些異常摺疊的蛋白質會進一步引起內質網應激，導致細胞凋亡。

因此，如果你使用過多的DNA，它本身就具有細胞毒性。 另乙個是脂質體本身的毒性。 事實上，對於細胞系的 293 系，最好的使用是像 pei 這樣的東西。

毒性低，轉染效率高，293系列細胞系可輕鬆達到80%。 Polyscience有一種粉末可以購買，購買後，直接將其製備到分子純度的水中的1ug ul溶液中，然後用1ug DNA 6ug pei轉染您的質粒以獲得293。

而且直接使用自製的pei非常便宜，在293上比商業脂質體好得多。

另外，如果你的實驗室真的有很多錢，不怕花錢，建議你服用Promega的Fugenhd，它比脂質體轉染效率更好，毒性更小。 也更高......

此外，您說漂浮細胞具有GFP的表面，這不一定是真正的GFP，而且很多時候。

轉染DNA？ 293噸 無論它如何轉彎，它都會變得更好...... 以哪個可以...

x 10 每孔 5 個細胞。

這是LIPO2000手冊中給出的建議。

如果您使用其他轉染試劑，說明書應具有推薦量，但差異不大。