細胞培養中需要注意哪些問題

1、實驗材料應新鮮，與活體分離後應低溫儲存，盡快進行細胞分離實驗。

2.無菌操作。 手術過程中使用的培養基可在細胞培養基中加入5倍於通常含量的青黴素。

3.酶法分離細胞時，注意酶溶液的濃度，控制消化時間。

貼片法分離細胞時，注意動作溫和，不要傷害細胞組織，組織塊的邊緣應盡可能平整，以利於細胞游離。

4.培養基的選擇。 不同的細胞對培養基中的營養物質有不同的要求，根據分離細胞的特性進行選擇。

傳代培養細胞培養：

1.無菌操作。

2.控制消化時間。

3、及時關注細胞的生長狀態。

1、為保證實驗材料的新鮮度，將材料與活體分離後注意低溫儲存。

2.應保證無菌操作。 可以在操作過程中使用的培養基中加入5倍於通常量的青黴素，這是不純的。

3、注意酶溶液的濃度，控制消化時間。

4、注意培養基的選擇。 不同的細胞對培養基中的營養成分有不同的要求，根據分離細胞的特性進行選擇。

無菌操作，控制消化時間，及時關注細胞的生長狀態。

最近，筆者一直在培養人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），以記錄志橋在細胞培養中的一些基本操作。

從37°C下裝有5%CO2的培養箱中取出細胞培養瓶，先觀察燒瓶內液體是否渾濁（渾濁表明細胞可能被汙染），然後在顯微鏡下觀察細胞的生長情況，當細胞長度超過70%時，即可傳代。

在25ml培養瓶中加入3ml PBS，洗滌兩次，然後加入胰蛋白酶（實驗室使用的仙人掌胰酶更溫潤銀），放入培養箱中消化3-5min（保證細胞消化），加入培養基（ECM）2ml停止消化。 將液體收集到離心管中，以350g離心5min（使細胞沉澱），然後除去上清液，在離心管中加入6ml ECM，將細胞吹勻（吹入單細胞），向三個25ml燒瓶各加2ml，然後在燒瓶中加入培養基至6ml。

25ml燒瓶中的細胞充滿後，用3ml PBS洗滌兩次，胰蛋白酶消化後離心，棄去上清液，加入培養基和500L DMSO（10%），將細胞吹勻，分裝成5個冷凍劑中，每個冷凍劑1ml，放入-80冷凍儲存中。

將凍存的細胞從-80或液氮中取出後，立即放入37°C溫水中（注意液氮是否洩漏到冷凍儲存管中），解凍後，以350g離心5min，棄去上清液，加入1ml ECM，吹幹細胞，加25ml培養瓶，補出ECM至6ml。

注意： a. 培養瓶蓋應通過酒精燈，培養瓶蓋不宜擰緊;

二。 75ml燒瓶為10ml培養體系，加胰蛋白酶消化，4倍用量培養基終止消化; 6孔板為培養系統（胰蛋白酶化），12孔板為2ml培養系統（胰蛋白酶化），24孔板為1ml培養系統（胰蛋白酶化），96孔板為100L培養系統（1滴胰蛋白酶消化）。 加入胰蛋白酶後，輕輕搖動燒瓶或培養板，使胰蛋白酶覆蓋貼壁細胞;

三。 用於清洗的PBS量是介質量的一半;

四。 25毫公升燒瓶中裝滿細胞，大約有乙個細胞;

五。 Huvec 在第 4 代之後不再可用。

Brineco Biotechnology - 為您解答： 1.合適的細胞培養基合適的細胞培養基是體外細胞生長和增殖的最重要條件之一。 培養基不僅提供細胞營養和促進細胞生長增殖的基礎物質，還為培養細胞的生長和繁殖提供了生存環境。

2.優質精華液目前，大多數合成培養基都需要新增精華液。 血清是細胞培養基中最重要的成分之一，含有多種生長因子和細胞生長所需的其他營養物質。 3、無菌無毒的細胞培養環境：無菌無毒的操作環境和培養環境是保證體外細胞培養成功的首要條件。

由於缺乏對微生物和有毒物質的防禦，體外培養的細胞一旦被微生物或有毒物質汙染或積累自身代謝產物，就會導致細胞中毒和死亡。 因此，在體外培養細胞時，需要保持細胞生活環境無菌、無毒，並及時去除細胞代謝物。 4.恆定的細胞生長溫度：為了保持培養細胞的旺盛生長，必須有乙個恆定和適當的溫度。

5.適宜的氣體環境氣體是哺乳動物細胞培養生存的必要條件之一。 所需的主要氣體是氧氣和二氧化碳。

1.實驗室設計。

細胞培養是一種無菌技術，需要沒有微生物汙染和其他有害因素的工作環境和條件。 細胞培養室和設計原則旨在防止微生物汙染和有害影響，並要求清潔、清新、乾燥和無菸的工作環境。 細胞培養工作包括：

工作液的製備、無菌操作（取樣）、孵育、無菌處理、細胞和用品的儲存等。 細胞培養室的設計實施原則一般是無菌操作區位於室內內側，移動較少，常規操作和密閉培養在乙個房間內，擦洗和消毒在另乙個房間。

2、常用的設施裝置。

1）超淨工作台：又稱淨化工作台，分為側流式、直流式和外流式三大類。

2）無菌手術室：一般由更衣室、緩衝室和手術室三部分組成。手術室配有淨化臺、二氧化碳培養箱、離心機、倒置顯微鏡等。 緩衝室可用於存放冰箱、冰箱和滅菌無菌物品。

3）操作室：普通培養箱、離心機、水浴、計時器、普通天平及日常分析處理專案。

4）洗滌消毒室：烘箱、滅菌器、蒸餾水處理器、酸罐等。

5）分析室：顯微鏡、電腦、印表機等。

3.培養器皿。

細胞培養以玻璃器皿為主，通常製備所需最大量的三倍。 器皿應採用透明性好、無毒、硬度中性的玻璃製品製成。 以下型別的玻璃器皿是常用的。

1）儲液瓶：用於儲存各種配製的培養液、血清等液體，常用500ml、250ml、100ml生理鹽水瓶或血漿瓶代替。

2）培養瓶：根據培養細胞的型別，不同培養瓶的形狀不同，用於細胞傳代培養的細胞要求壁厚均勻，便於細胞貼壁生長和觀察，瓶口大小應一致，口徑一般不小於1cm，並允許吸管伸入瓶子的任何部位， 規格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等。外周血培養常用的10ml普通圓瓶。

兩個燒瓶都需要由優質玻璃製成。

3）培養皿：用於開放培養等目的。它分為直徑30mm、60mm、120mm等。

4）吸管：吸管有兩種型別：長吸管和短吸管，長吸管也稱為刻度吸管。改性管的上部有乙個球形刻度，稱為改性吸管，刻度吸管用於移動液體。

常用的型別有兩種：1ml和10ml。 短吸管，也稱為滴管，分為肘頭和直吸管兩種。

5）離心管：離心管是細胞培養中使用最廣泛的容器，根據用途形式不同，細胞培養中常用的離心管有兩種型別：大肚尖底離心管和普通比色皿離心管。前者分別為50ml、30ml和15ml; 後者大多是10ml和5ml。

6）其他：如三角瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。

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BioLife BioLite Thawstar 細胞程式復甦儀。

細胞的儲存和運輸應在冷凍儲存條件下實現，細胞的提取和應用通常採用水浴的解凍和復甦方法，而傳統的水浴解凍和復甦則面臨無法控制和管理的問題，人的主觀誤判和水浴的汙染帶來了一定的風險。

2019年4月，Biolife Solutions全資收購Astero及其細胞程式復甦公司的智財權，並資助了THAWSTAR細胞程式復甦技術高階模型的開發，其中CFT系列模型已應用於全球生物製藥公司、研發公司、大學研究單位，甚至醫院實驗室， 回收效果得到業界認可。作為Astero中國的合作夥伴，上海拉西工業科技有限公司在中國大陸、香港和台灣銷售全系列的Astero產品。

Thawstar細胞程式復甦裝置。

它是一種用於程式化細胞回收的儀器。 與傳統的水浴操作相比，該儀器操作簡單，重複性好，可有效避免操作過程中的汙染風險。 由於該儀器可自動執行一系列程式化復甦操作，因此消除了基於操作人員主觀猜測的錯誤操作和汙染的風險，並且重現性很高！

THAWSTAR系統適用於儲存在乾冰、-80冰箱、液氮等上的冷凍細胞。 操作很簡單，例如，ThAWSTAR CFT2只需插入小瓶中並等待其完成，當處理完成後，小瓶將自動彈出。

THAWSTAR CFT細胞程式復甦裝置可以直接在生物安全櫃的BSC中進行！

1.恢復。

1.從液氮中取出小瓶，立即將其放入37水浴中，輕輕搖晃。 液體融化後（大約幾分鐘），將其取出並噴灑一些酒精，然後將其放入乾淨的工作台中。

2.將上述細胞懸液吸入含有10ml培養基的15ml離心管中（用培養基洗滌冷凍管以洗掉粘附在壁上的所有細胞），並以1000rpm離心5分鐘。

3.倒掉上清液，加入1ml培養基懸浮細胞。 吸入裝有10ml培養基的10cm培養皿中，輕輕來回左右搖晃，使培養皿中的細胞均勻分布。

4.標記細胞型別和日期、培養者名稱等，放入CO2培養箱培養，細胞貼壁後更換培養基。

5.每 3 天更換一次培養基。

2.生成。

1.當培養皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時傳代。

2.吸出原始介質。

3.加入適宜的胰蛋白酶（只要能覆蓋細胞即可）消化1-2分鐘。

4.細胞變圓後，加入等體積的含血清培養基以終止消化。

5.用移液器將細胞懸浮。

6.將細胞吸入15ml離心管中，並以1,000rpm離心5分鐘。

7.倒掉上清液，加入1-2ml培養基，然後將細胞全部吹勻。

8.根據細胞型別，將細胞轉移到多個培養皿中。 一般來說，有 5 個癌細胞和 3 個正常細胞。 繼續耕耘。

3.冷凍儲存。

消化細胞並離心（同上）。 用製備的冷凍儲存溶液懸浮細胞，將它們分裝到滅菌的冷凍儲存管中，靜置幾分鐘，並註明細胞型別和冷凍儲存日期。 4 30min、-20 30min、-80 過夜，然後放入液氮灌溉儲存。

凍存溶液製備：70%完全培養基+20%FBS+10%DMSODMSO應緩慢新增，並隨時搖晃。

注意無菌操作！