關於定量PCR螢光訊號強度

5個回答

匿名使用者2024-02-06

1、如果有標準曲線，按標準曲線計算;

2、一般為相對量，採用deltadeltact法計算;

3.引物或探針降解：其完整性可通過PAGE電泳檢測;

4、模板用量不足：對於濃度未知的樣品，應從最高濃度的連續稀釋樣品開始;

5.看CT值是螢光定量PCR分析最直觀的資料，CT值一般在35左右失去參考值，我們實驗室用biodai-PCR螢光定量法測得的擴增曲線起始值基本在30左右。
匿名使用者2024-02-05

影響螢光PCR的因素有很多，但從操作和技術角度來看，有幾點需要注意：

RNA完整性。

因為一旦RNA降解，定量結果就不能正確反映樣品中mRNA的量，得到的結果也是錯誤的。因此，在RNA提取過程中，必須嚴格遵循操作規範，避免被RNA酶汙染。

RNA樣本中的基因組DNA汙染。

提取的RNA樣品不可避免地含有少量的基因組DNA。基因組DNA對實驗有兩個影響：一是影響RNA的精確定量; 二是影響PCR擴增的特異性。

優化PCR反應體系。

PCR擴增過程必須保證擴增產物只有特定的靶產物，為此，必須首先優化PCR反應體系。目前，許多公司都有實時螢光定量PCR反應試劑盒，可以方便PCR反應的操作。

反轉錄。通過逆轉錄獲得的cDNA量必須與相應mRNA的量完全相等，而逆轉錄是實時螢光定量PCR的關鍵步驟。目前常用的逆轉錄酶有兩種型別：

AMV-RT 和 MMLV-R。通常用於逆轉錄的引物是隨機引物、oligo-dt 和特異性引物曲率。相比之下，Oligo-DT和特異性引物更適合實時螢光定量PCR。

5.使用實時螢光定量PCR研究基因表達時，必須使用內標基因進行相對定量。可靠的內標基因應該是在不同細胞型別和不同測試條件下穩定表達的管家基因。

常用的內標基因有-tublin、肌動蛋白、

GAPDH、18SRNA、EFLA 和 Cyclophilin 等。雖然在大多數情況下，這些管家基因的表達非常穩定，但是。

最近，有報道稱，這些管家基因的表達在某些情況下會發生變化。也就是說，並非所有內標基因都適合。

任何試驗。在選擇內標基因時，應慎重考慮多種因素，選擇合適的內標基因或內標基因組合。
匿名使用者2024-02-04

實時螢光定量PCR是指在PCR擴增反應體系中加入螢光基團，實時檢測擴增反應中各迴圈產物的螢光訊號，最後通過標準曲線對未知模板進行定量的方法。控制項的目的是監控測試的各個方面，因此我們按照測試流程對控制項進行整理和沖洗。常規PCR的工作流程為：

樣本採集-運輸-樣本程式碼處理-核酸提取-逆轉禪判斷（RNA病毒）-擴增-結果讀取。
匿名使用者2024-02-03

當有入射光照射到物質時，它的分子會吸收入射光的能量並被激發，使其電子從低能級躍公升到高能級，這時，激發態的分子結構不穩定，會通過躍遷失去能量，回到基態，這個過程將伴隨著螢光或磷光的產生。如圖所示。

所有螢光物質都具有兩種特徵光譜，即激發光譜和發射光譜。

通常，物質發射光的波長總是大於其激發光的波長，因為在接收物質激發的過程中存在一定的能量損失。激發光和發射光的波長之間的差異稱為斯托克位移。

螢光物質分子與溶劑或溶質分子之間發生的導致螢光強度降低的物理或化學過程。

螢光猝滅的形式很多，機理也很複雜。主要有幾種型別：

螢光定量PCR技術是測定樣品中特定PCR片段的相對量和絕對量的方法，是測定特定PCR片段含量的方法。例如，患者樣本中病原體的含量、實驗樣本中特定mRNA的含量等。為了實現高效反應，實時螢光定量PCR應用的引物應設計為產生短擴增子。

常用的方法有SYBR Green的螢光染料法和TaqMan探針法，兩種方法的特點和應用如下表所示

由於不同螢光定量PCR儀器的原理和提供的檢測光的光譜範圍不同，根據所用儀器型號設定的可檢測螢光訊號範圍來選擇探針的發光和淬滅基團很重要（探針方法可以連線到我們的螢光定量PCR試劑盒的編號和對應的機器型號）。

由淬滅劑Tamra、Eclipse或BHQ系列染料組成的雙標記螢光探針通常用作水解探針，或稱為水解探針"taqman"用於實時螢光定量PCR實驗的探針。由於這些淬滅染料的光譜特性不同（見下圖），它們作為淬滅基團的特性也不同，如下所述
匿名使用者2024-02-02

這是因為DNA複製量沒有達到儀器檢測到的水平，但實際的PCR週期是真實的，反映在儀器曲線上作為基線，直到定量變化達到質變，成為指數增長期時，儀器才會檢測到。

一般以螢光PCR的前15個週期作為螢光背景訊號（基線、基線），即樣品的螢光背景值和陰性對照的螢光值，放大後的螢光訊號被螢光背景訊號掩蓋。

螢光閾值是螢光放大曲線上人為設定的值，可以在螢光訊號指數放大階段的任意位置設定，螢光域值的預設設定是螢光訊號標準偏差的10倍，持續3 15個週期（由機器自動設定）。

在進行螢光定量PCR實驗時，常採用手動設定，手動設定的原則應大於樣品的螢光背景值和陰性對照的最大螢光值，同時應盡可能選擇進入指數相的初始階段，而真正的訊號是螢光訊號超過域值。