PCR a基因超過2000 bp引物設計

目標產品的長度通常與引物設計關係不大。 設計時應注意以下幾點：

1.引物的長度一般為15-30 bp，常用為18-27 bp，但不應大於38，因為太長會導致其伸長溫度大於74，不適合Taq DNA聚合酶反應[2]。

2.引物序列在模板內不宜具有較高的相似性，尤其是3'端相似度高的序列，否則容易造成錯配。 引物的3'端存在三個以上的連續鹼基，如GGG或CCC，也會增加錯誤起始的可能性[2]。

3.引物3'端的最後乙個鹼基對Taqase的DNA合成效率有很大影響。 不同的末鹼基導致失配位置的擴增效率不同，且末鹼基A的失配效率明顯高於其他3個鹼基，因此應避免在引物3'端使用鹼基A[3][4]。

此外，引物二聚體或髮夾結構會導致PCR反應失敗。 5'末端序列對PCR影響不大，因此通常用於引入修飾位點或標記物[2]。

4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利於引發反應。 上游和下游引物的GC含量不應相差太大[2][5]。

5.與引物相對應的模板位置序列的 TM 值約為 72，使復性條件達到最佳狀態。 有幾種方法可以計算TM值，例如根據公式TM 4（G+C）2（A+T），最近鄰法用於寡核苷酸軟體[6][7]。

6.δg值是指DNA雙鏈體形成所需的自由能，它反映了雙鏈體結構中鹼基對的相對穩定性。 應選擇3'端ΔG值較低（絕對值不超過9個）和5'端和中間體ΔG值相對較高的引物。

引物3'端的δg值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構，引發DNA聚合反應[6]。

7.引物-二聚體和髮夾結構的能量值過高（超過它們容易導致引物-二聚體條帶的形成，降低引物的有效濃度，從而阻止PCR反應正常進行[8]。

8.引物修飾通常通過在5'端新增酶切割位點來完成，該酶切割位點應根據下乙個實驗中將PCR產物插入的載體的相應序列來確定。

值得一提的是，底漆設計的難度因模板而異。 有些模板本身比較困難，比如GC含量高或低，導致無法找到適合各種指標的引物; 在用於轉殖目的的PCR中，產物序列相對固定，引物設計選擇的自由度較低。 在這種情況下，我們只能滿足於下乙個最好的事情，並努力滿足條件。

網上有很多關於PCR引物設計的規則，相信大家可能都看過了。

放輕鬆，我當時用的pp5並不是說他設計的引物分數低就不能把p拿出來，這些都不是絕對的。 第一次設計底漆時，它不是那麼平靜。 事實上，你可以請你的兄弟姐妹教你，這樣你就不會耽誤你的實驗。

您也可以嘗試設計一對或兩對引物，然後用PCR進行嘗試。 因為PCR畢竟不是那麼難，當然我沒聽懂你的話題，如果你真的想讓PCR的產物有2000個bp以上，那也有點麻煩。 就像我以前做原核表達時一樣，基本的引物是固定在兩端的，它們仍然可以是p-out。

最近我乙個同學做了PCR，產品也是2000BP，他剛好解決了這個問題，因為mg離子濃度的問題，優化PCR條件也很重要。 事實上，一般來說，按照一般系統，這是完成的，Takara的緩衝液是現成的，並且mg離子是分離的。

其實聊了很久，我並沒有為你設計引物。 我只想說，放輕鬆...... 規章制度太多也沒用，同學們他們設計入門就用眼睛看，是不是一定要系統地打100分，當然要考慮到實驗的成本，試試看，祝你好運。。

無需費力，只需選擇自己的擴增片段，並從兩端選擇18-25 bp的序列作為引物即可。

沒關係，只要不形成典型的迴圈，或者兩個引物認真配對（50%以下就好了）最重要的是可以放大，想那麼多也沒用，畢竟實驗是試過了。

此外，合成引物現在並不昂貴

總結。 同學們大家好！

每條子鏈的合成都需要引物。 PCR複製n次，產生的DNA數為2 N，每個DNA有兩條鏈，總共2 N*2=2（N+1），然後減去兩條母鏈，所以至少需要將引物數2的N+1冪加減去2。

每次複製都需要一對引物。 通常，新增到反應中的引物是過量的。

“引物”是作為DNA複製起點的一小段DNA，當一次複製完成時，引物不在鏈上，而下一次複製完成後，引物也需要複製。

在PCR擴增中獲得多少含有一種引物的DNA。

同學們大家好！ 每個子鏈的合成都需要乙個引線。 PCR複製n次，產生的DNA數為2 N，每個DNA有兩條鏈，總共2 N*2=2（N+1），然後減去兩條母鏈，所以至少需要將引物數2的N+1冪加減去2。

每個副本都需要一對引物。 通常，新增到反應中的引物是過量的。 “引物”是一小段DNA，其作用於：

作為DNA複製的起點，當一次複製完成時，引物不在同一條鏈上，下次進行複製時，也需要複製引物。

複製的DNA含有多少個引物？

DNA複製需要引物，如果DNA複製n次，則至少需要在緩衝液中加入2N+1-2引物。 DNA分子的每次複製，都需要一對來自棗科的引物，複製n次，總共需要2n個DNA分子，需要2n+1個引物，需要親本的乙個DNA分子（不需要來自小燕的引物），因此需要在緩衝液中加入至少2N+1-2個引物。

為什麼親本的DNA分子不需要引物？

這是由於“DNA聚合酶”和“RNA聚合酶”的性質不同。 抗作用的 DNA 聚合酶之前必須有一小塊 RNA 引物; RNA聚合酶不需要任何引物，可以從頭開始合成。 DNA合成需要引物，可以保證DNA複製的高保真度，因為引物的合成非常不穩定，容易進入錯誤的鹼基，所以DNA合成後，引物會被切除，然後補充DNA，使其完整。

DNA是遺傳物質，所以有這個防錯的複製系統。 RNA不那麼重要，所以它沒有像Muqing那樣複雜的防錯系統。

DNA會包含兩個引物嗎？

是的。 乙個基因被擴增了四次，得到的DNA總共含有15個引物。 為什麼。

如果是雙鏈，第乙個迴圈應包含1對底漆，第二個束鍵應為2對，第三個橡木巖喬應為4對，第四個應為8對。 共15對。 上游和下游引物共15種。

好的，謝謝你，老師。

豎起大拇指是可以的。

點選這裡結束諮詢。

謝謝。

引物在PCR中的作用是在DNA複製開始時充當DNA聚合酶的結合位點，在細胞外條件下，DNA只能通過引物開始複製。

合成的兩段寡核苷酸序列，其中一條引物在目標區域的一端補充一條 DNA 模板鏈，另一條引物補充目標區域另一端的另一條 DNA 模板鏈。

PCR反應中有兩種引物，5端引物和3引物。 引物是基於單鏈DNA設計的（通常基於資訊鏈），5端引物與待擴增片段5端的一小段DNA相同; 3 端引物與位於待擴增片段第 3 端的一小段 DNA 序列互補。