質粒提取的原理和步驟，質粒提取方法

提取原理是基因重組。

看看這個，我們都用這個方法。

從具體操作方法上可分為鹼裂解法、煮沸法、牙籤法等。

在氫氧化鈉（鹼性環境）和洗滌劑SDS的作用下，細菌蛋白變性，細胞破碎，細菌染色體DNA DNA變性，雙鏈DNA氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結構破壞變形。

然而，由於質粒DNA的相對分子量較小，普通價閉環的DNA雖然變性，但仍處於拓撲纏繞狀態，並具有環狀超螺旋結構，即使在高鹼性pH條件下，兩條互補鏈也不會完全分離。

當pH值調節至中性且鹽分高時，變異質粒DNA恢復到原來的構型，而大部分染色體DNA和蛋白質難以還原，與細胞碎片、蛋白質、SDS等形成不溶性複合物。

通過離心和沉澱，細胞被分割，染色體DNA和大多數蛋白質可以被去除，而質粒DNA和分子量相對較小的RNA仍然可溶。 混合的RNA可以通過RNA酶消除，然後用苯酚氯仿處理以去除殘留的蛋白質。 在鹽和乙醇存在下，進一步離心析出質粒DNA。

程式。 （請自備50ml離心管、20ml離心管、異丙醇、70%乙醇）。

1.取菌液50ml，置50ml離心管中，以4000rpm離心5min，完全棄去上清液。

2.加入溶液A20ml，搖勻2min，使細菌完全懸浮，確保不存在絮凝物。 以4000rpm離心5min，完全棄去上清液。

3.加入溶液I和溶液B40ml，搖勻2min，使細菌完全懸浮，確保不存在絮凝體。

4.加入溶液II4ml，蓋緊蓋子，輕輕倒置混合6次，注意管子的整個內表面需要與溶液II接觸，並在室溫下放置，直到溶液澄清。 （一般為4-5min，如果5min後溶液仍未變清，則說明細菌過多，應減少細菌溶液的用量。

小心輕柔地混合，不要猛烈混合）。

5.加溶液iii3ml，緊閉管，一次輕輕倒置混合8次，靜置4分鐘，靜置5min。 （在此步驟中，請注意盡快混合，但技術應溫和）。

6.以10,000rpm離心4分鐘，持續15分鐘，小心地吸出上清液並輕輕轉移到新的20ml離心管中。 （離心機自動停止後應拆下離心管，避免沉澱懸浮液）。

7.加入異丙醇6ml，混勻，室溫放置10min。

8.在室溫下以10,000rpm離心15分鐘，小心地吸出上清液，並將離心管倒置在吸水紙上以吸走殘留的液體。 （離心機自動停止後應拆下離心管，以免析出。

懸停） 9加入 3ml 70% 乙醇，溫和** 30 秒，以 10,000 rpm 離心 10 分鐘，輕輕棄去上清液。

10.重複步驟9，倒置在乾燥的吸水紙上2分鐘。

11.將離心管在室溫下開啟 5 分鐘，讓顆粒乾燥。

12.加入 100 L 溶液 IV，輕輕** 2 分鐘，使沉澱完全溶解。

注意事項： 1.溶液II和溶液III如果發生結晶或沉澱，可在37水浴中加熱幾分鐘溶解，直至液體恢復澄清。

2.提取的生物質粒量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。 如果質粒是低拷貝質粒或大於 10 kb 的大質粒，則應擴大細胞大小。

要使用的量，同時按比例增加溶液I、溶液B、溶液II和溶液III的量。

1.利用氯黴素的特性抑制染色體複製，但不抑制質粒複製，在培養低拷貝質粒（如PUC19）時新增氯黴素可大大提高產量。

2. 首先使用 RNA se 去除 RNA。 向溶液 I 中加入高濃度的 RNA SEA （100 ug mL），或用 25 ug RNase MLTE 溶解提取的質粒，可以減少 RNA 保留，但兩者都不能完全去除。

3.蛋白質的去除主要取決於不溶性k-SDS-蛋白質複合物的形成。 雖然可以通過將中和系統在 4C 下放置一段時間來形成更多的這種不溶性複合物，從而減少蛋白質殘留物，但已經表明，除非大量提取，否則沒有必要這樣做。

首先，質粒提取可分為質粒提取、質粒提取和質粒提取。 目前，大多數實驗室都使用試劑盒進行提取，可以根據實驗的不同需求選擇相應的試劑盒。

質粒提取主要用於從大腸桿菌中小額提取質粒DNA，得到的質粒可用於常規載體構建，一般適用於5ml以下的細菌溶液。

質粒提取，在小提取的基礎上，可進一步去除細菌溶液中的內毒素，得到的質粒可用於細胞轉染，細菌溶液用量為10-15ml。 質粒提取與培養基提取相同，一次提取100ml-300ml細菌溶液可獲得大量質粒。

小規模提取副質量旁生DNA的原理主要包括：1裂解細胞和核醣體以釋放質粒DNA。

SDS和蛋白酶K常用於破壞細胞結構，裂解細大便細胞和核醣體，釋放各種DNA，包括質粒DNA、宿主染色體DNA等。 2.脫蛋白。

加入苯酚氯仿等有機溶劑可以去除相關蛋白質並留下沉澱的DNA。 蘇木精和異丙醇的加入允許 DNA 的選擇性沉澱，此時質粒 DNA 和宿主 DNA 同時沉澱。 4.

選擇性吸附。 使用吸附的質粒 DNA（例如矽柱）洗脫宿主 DNA。 矽柱對質粒DNA和宿主DNA具有不同的親和力，可以選擇性吸附質粒DNA，洗脫宿主洗脫，轉運殘留濃縮DNA。

用緩衝液（如TE緩衝液）洗脫矽柱並收集質粒DNA。 離心可用於濃縮並獲得少量質粒DNA溶液。 6.

可選PCR擴增。 如果得到的DNA濃度不足，可以使用PCR擴增來獲得更高濃度的質粒DNA。 因此，該方法通過細胞裂解、脫蛋白、選擇性沉澱和吸附的原理實現少量質粒DNA的提取，並通過PCR達到更高的濃度，這是質粒DNA少量提取的原理。

P1：葡萄糖可防止大腸桿菌懸浮液迅速沉積到管底; EDTA是Ca、Mg等二價金屬離子的螯合劑，其主要目的是螯合二價金屬離子，達到抑制DNase的活性。 可以新增 RNase A 來消化 RNA。

P2：這一步是鹼處理。 其中，NaOH主要用於裂解細胞和釋放DNA，因為在強鹼度的情況下，細胞膜會發生由雙層膜結構向微膠囊結構的轉變。

SDS與NaOH合用，增強NaOH的強鹼度，SDS作為陰離子表面活性劑破壞脂質雙層膜。

溶液III的作用是沉澱蛋白質並中和反應。 其中，醋酸鉀是用鉀離子取代SDS中的鈉離子並形成PDS，因為十二烷基硫酸鈉遇到鉀離子後變成十二烷基硫酸鉀，而PDS不溶於水，同時乙個SDS分子平均結合兩種氨基酸，取代鉀鈉離子產生的大量沉澱自然沉澱大部分蛋白質。

2M的乙酸是中和NaOH。 基因組DNA一旦斷裂，只要是50-100 kb大小的片段，就沒有辦法被PDS共沉澱，所以鹼處理時間要短，不要劇烈搖晃，否則最終質粒上總會有大量的基底病灶和滲透基團DNA混雜， 通過瓊脂糖電泳可以觀察到緻密的總DNA條帶。

75%酒精主要用於清潔鹽分和抑制DNase; 同時，溶液III的強酸性也使DNA更好地與矽酸鹽纖維膜結合。

1.在瓊脂培養皿上挑選單個菌落，並以37 150rpm轉/分轉移到3-10ml LB培養基中過夜。

2.將培養物移液到 Eppendorf 管中，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄去上清液體積。

3.將細菌沉澱懸浮在100L溶液（GTE溶液）中，並充分混合並強烈搖晃。

4.加入200L新鮮製備的溶液（NaOH SDS溶液），蓋緊蓋子，輕輕倒置離心管數次，使內容物混合，並在冰上放置5-10分鐘。

5.加入150公升溶液（5mol l醋酸鈉），輕輕倒置幾次，使溶液充分混合，並在冰上放置3-5分鐘。

4離心10分鐘，將上清液轉移到另乙個離心管中。

7.加入等體積的苯酚：氯仿，振盪充分混合，10,000rpm，4次離心2分鐘，然後將上清液轉移到另乙個離心管中。

8.加入兩倍體積的無水乙醇以沉澱雙鏈DNA，充分混合，並在房間中放置2分鐘。

4 離心機 10 分鐘。

10.棄去上清液，加70乙醇1ml洗滌沉澱雙鏈DNA，10000rmp，4離心5分鐘，倒入全部乙醇，吸出噴嘴處殘留的乙醇。

11.加入 40 g ml RNase TE 緩衝液以溶解 DNA。