關於PCR轉殖基因引物的問題

你看，你分別得到 1-1200 nt 和 1000-1400 nt 序列，所以中間的 200 bp 序列是重疊的，對吧？ 也就是說，您已經從序列資訊中獲取了此 CD 區域中的所有序列資訊。 如果您只需要序列資訊，這就足夠了，但如果您需要為後續實驗擴增完整的 1400 bp，則需要繼續擴增完整的 CD 區域。

如果是這樣的話，我有個竅門，可以把1-1200 nt和1000-1400 nt的片段混合使用作為模板，然後用引物A和D進行擴增，可以輕鬆得到完整的1400 bp產物，但前提是第一步退火時，時間適當更長， 這樣可以將兩個大片段混合退火，即兩個片段重疊的200 bp部分可以退火，方便您放大。

PCR反應條件。 當用引物A和D擴增時，72度延伸步驟的延伸時間是否足夠？

如果您需要完整的CD區域進行後續實驗，則需要繼續完整地擴增CD區域。

可以做梯度PCR，效果明顯; 或者，您可以使用 LA Taq。 希望對您有所幫助

乙個引物與靶區一端的一條DNA模板鏈互補。

引物是合成的兩段寡核苷酸組耐銀核苷酸序列，乙個引物與靶區一端的DNA模板鏈互補，另乙個引物與靶區另一端的另一DNA模板鏈互補，其功能是作為核苷酸聚合的起點， 核酸聚合酶可以從其 3 端合成一條新的核酸鏈。

PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使它們能夠有效地擴增模板DNA序列。 如前所述，引物的質量直接關係到PCR的特異性和成功。 引物的設計不可能有乙個包羅永珍的規則來確保PCR的成功，但遵循某些原則可以幫助引物的設計。

PCR引物設計原則。

1、引物長度一般為15-30bp。

引物的長度一般為15-30 bp，常用的為18-27 bp，但不應大於38 bp，因為太長會導致其伸長溫度大於74，不適合Taq DNA聚合酶反應;

2、引物GC含量一般為40%-60%。

引物的GC含量一般為40%-60%，45-55%為宜，GC含量過高或過低均不利於引發反應。 上下游引物的GC含量和TM值應保持接近;

3.引物對應的模板序列的TM值應為72左右。

tm 值約為 72 可以使復性條件達到最佳狀態，至少在 55-80 之間。 TM值的計算方法有幾種，如根據公式TM 4（G+C）2（A+T），在Oligo軟體中使用最近鄰法;

4.底漆3'端的鹼基一般不使用A。

引物 3' 端的鹼基通常不使用 A，因為 A 在錯誤的引物位點相對有效。

5.引物3'端存在3個以上連續鹼基，如GGG或CCC，也會增加出錯概率。

6.引物3'端的互補、二聚體或髮夾結構也可能導致PCR反應失敗。

7.如果編碼區被擴增，引物的3'端不應終止於密碼子的第3位，因為密碼子的第3位容易發生變性，會影響擴增的特異性和效率

8.底漆的5'端可以改性。

引物的5'末端序列對PCR影響不大，因此常用於引入修飾位點或標記物。

9.鹼基應隨機分布，引物本身與引物之間不應有4個連續的鹼基互補。

引物在PCR中的作用：找到一對合適的核苷酸片段，使它們能夠有效地擴增模板DNA序列。

引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，乙個引物補充目標基因一端的一條 DNA 模板鏈，另乙個引物補充目的基因另一端的另一條 DNA 模板鏈。

在PCR（聚合酶鏈式反應）技術中，已知乙個靶基因的核苷酸序列，並根據該序列合成引物，使靶基因的DNA受熱變性變性成單鏈，引物與單鏈相應的互補序列結合，然後在DNA聚合酶的作用下延伸， 使迴圈重複，延伸後得到的產物也可以與引物結合。

引物的本質是核苷酸序列，在DNA複製開始時作為DNA聚合酶的結合位點，具體的PCR原理是利用DNA分子在體外95°C的高溫下變性並鬆散成單鏈，然後冷卻到60°C左右， 引物將引物根據鹼基互補原理與單鏈DNA結合，然後公升溫至72°C左右，即DNA聚合酶的最佳反應溫度，DNA聚合酶從3'末端開始合成相應的互補鏈，沿新核酸鏈的方向，以此類推，達到DNA分子擴增的目的。

可以在引物中找到。

新增未配對的鹼基，但引物的 3' 端中至少有三個是緊密配對的。 然而，這種操作主要是為了新增酶切割位點或標誌。

tm 值是根據兩條鏈的退火計算的，未配對的鹼基不計算在內，因此新增未配對的鹼基對 tm 值幾乎沒有影響。

保證長度 – 無需新增未配對的鹼基。

不產生二聚體。

也沒有必要，引物本身的鹼基配對對擴增影響不大，引物之間的二聚體可以根據引物位置的選擇來避免，如果不能避免，則要保證3'端沒有配對。

因此，不建議在設計引物中新增不必要的鹼基。 （部分干擾實驗除外）。

不是引物上的每個鹼基都必須與模板鏈互補，但像圖中看到的那樣的設計是不可能的，一般引物的5'端可以與模板完全不同，這樣就可以在PCR中擁有引物酶消化位點等， 但 3' 端必須與模板鏈結合，因為 Taq 酶在 5-3 方向上延伸，如果 3' 端翹起，則無法延伸。如果引物的 3' 末端與模板下游的某處結合，則它將成為缺失片段的 PCR。

我認為沒有必要，但未配對鹼基的數量應該盡可能少，消化位點或活性位點等關鍵位置應該盡可能保守。

引物 3'末端鹼基，尤其是最後乙個和倒數第二個鹼基，應嚴格配對，避免因末端鹼基錯配導致PCR失敗。

在PCR反應中，新的DNA鏈是從引物的3'端合成的。 因此，在新合成的DNA鏈中，原始引物位於5'端，新的蘆葦磨機在3'端新增鹼基。

引物的3'端是關鍵鹼基，是PCR延伸的起始端，不能以任何方式修飾，也不能形成二級結構的可能，3'端不能錯配，應嚴格要求配對，避免因末端鹼基錯配而導致PCR失敗。

5'端沒有嚴格限制，只起到限制PCR產物長度的作用，對擴增的特異性影響不大，因此常用於引入修飾位點或標記物。 陪伴戰鬥。

可以在引物中加入合適的酶切位點，擴增的靶序列最好具有合適的酶切位點，這對於酶切分析或分子轉殖非常有利。

每個引物的濃度為1umol或10 100 pmol，這是產生最小量引物殘留的最佳結果，因為高引物濃度會導致錯配和非特異性擴增，並會增加引物之間形成二聚體的機會。