如何監測PCR實驗室汙染

合格的PCR實驗室應始終做好汙染監測工作。 考慮是否存在汙染以及導致汙染的原因。 以便及時採取措施預防和消除汙染。

1.設定陰性對照。

每次進行PCR實驗時，請務必進行陰性對照，包括標本對照、試劑對照和空白對照。 標本對照：標本對照應盡可能使用相同組織結構的標本。

試劑對照：PCR擴增在PCR試劑中不進行模板DNA或RNA，以監測試劑是否被汙染。 空白控制：

雙蒸水可用於監測整個實驗環境的汙染情況。

2.設定陽性對照。

每次PCR實驗都應提供PCR陽性對照，這是PCR反應成功的重要參考標誌物。 對於陽性對照，應選擇具有中等擴增率和良好重現性的標本。 並注意交叉汙染的可能性。

實驗穩定後，可省去陽性對照。

3.進行重複性試驗。

4.選擇來自不同地區的引物進行PCR擴增。

汙染原因：

1）標本間交叉汙染：標本汙染主要包括採集標本的容器受到汙染，或標本之間因密封不良而在放置標本時溢位到容器外，或標本粘在容器外部;在標本核酸模板的提取過程中，標本之間的汙染是由取樣槍的汙染引起的。 一些微生物標本，尤其是病毒，可以隨氣溶膠傳播或形成氣溶膠，導致相互汙染。

2）PCR試劑汙染：主要是由於PCR試劑製備過程中，PCR核酸模板被取樣槍、容器、雙蒸水等溶液汙染。

3.PCR擴增產物汙染：這是PCR反應中最常見和最常見的汙染問題。

由於PCR產物的拷貝量較大（一般為1013拷貝ML），遠高於數拷貝的PCR檢測限，極少量的PCR產物汙染可引起假陽性，形成假陽性。

4）很容易忽視PCR產物汙染最可能的形式是氣溶膠汙染;空氣和液體表面摩擦時可形成氣溶膠，操作時可劇烈搖晃反應管，開啟蓋子時、樣品被抽吸時、樣品被汙染時反覆取樣可形成和汙染氣溶膠。 據計算，乙個氣溶膠顆粒可以包含48,000個拷貝，因此由它引起的汙染是乙個值得特別關注的問題。

汙染後，我們首先認為可能是試劑汙染，用新批次的HBV試劑重新檢測後，所有標本的結果仍為陽性。

將HBV標本帶到其他常規PCR實驗室進行檢測，結果顯示標本結果為陰性和陽性，陰性對照為陰性，陽性對照為陽性，說明標本未被汙染，兩批HBV試劑帶到其他常規PCR實驗室進行檢測， 並且還表明試劑沒有問題。

在實驗室用消毒劑擦拭工作檯面後，我開啟了一天的所有紫外線燈，更換了微量取樣器、離心管、移液器頭、手套、記號筆、記錄簿等，然後對HBV標本進行了檢測，結果還是陽性的。

用消毒劑擦拭工作表面後，開啟所有紫外線燈一天，重新檢測HBV標本，同時設定兩個陰性對照（A和B），陰性對照是從試劑盒中取出試劑的反應管，開啟反應管的蓋子，暴露在空氣中10min， 蓋上蓋子，在機器上測試;b 陰性對照是將試劑的反應管從試劑盒中取出，不開蓋，直接在機器上進行檢測。 結果是所有標本和陰性對照均為陽性，而陰性對照b為陰性。

到目前為止，雖然無法查明汙染源是什麼，但有一點是肯定的，PCR實驗室汙染是由氣溶膠的擴散引起的，經過調查，發現汙染是由於在清潔實驗室時，在放大區用掃帚和拖把對標本準備區進行衛生造成的。

在確定汙染原因後，我們著手通過每天開啟整個PCR實驗室的門窗和排氣扇，給整個實驗室通風，用消毒劑擦拭整個PCR實驗室，並開啟所有紫外線燈來消除汙染。

按3 5步每3 d進行一次試驗，持續1個月，A陰性對照轉陰性。 對A和B陰性對照連續三次檢測，每次檢測結果均為陰性，證實PCR實驗室已恢復正常。

通常我們在PCR實驗室預防汙染的做法是隔離不同的操作區域，對試劑進行分隔，改進實驗操作等，汙染的處理是用稀鹽酸擦拭或浸泡; 紫外線照射法等]。為了防止實驗室之間的相互汙染，每個實驗室都盡可能封閉，這增加了實驗室內PCR產物殘留汙染的概率。 從PCR實驗室的汙染去除過程來看，我認為消除汙染的關鍵之一是通風。

實驗室的適當通風可以起到空氣稀釋的作用，有利於減少PCR產物殘留，消除實驗室汙染。

用紫外線燈照亮實驗室，並用酒精擦洗儀器。

PCR實驗中最令人恐懼的問題是什麼？ 當然，對於來之不易的結果來說，這是乙個誤報。

當PCR出現假陽性時，我們經常會考慮是不是引物混合物*等被汙染的模板，然後一一檢查。

在這裡，我認為我們應該廣泛思考一下，為什麼這些試劑和儀器會受到汙染？ 事實上，這是核酸氣溶膠汙染。

離心機 離心 用力搖晃反應管 裂開PCR的蓋子 抽吸和重複移液器等的樣品時，空氣與液體表面之間會產生摩擦，從而產生核酸氣溶膠，即實驗室（或移液器）中充滿了含有不同長度核酸片段的小水滴或小顆粒， 這些小顆粒沉降（擊中）到空白樣品中，最終放大條帶。

可想而知，這些小核酸液滴也會落在實驗表面、PCR儀、移液器*頭*盒等上，如果我們不注意，這些核酸液滴會隨著時間的流逝而積累，在實驗中會出現特殊的問題，比如PCR假陽性。

那麼，如果我們平時實驗或實驗室管理中的核酸氣溶膠（即核酸的小液滴）產生巨大的汙染，我們該怎麼辦呢？

大面積核酸汙去除操作方法：

1）使用核酸氣溶膠汙染清除劑（PCR清洗劑）對大面積的汙染區域進行處理，包括：地板、牆壁、天花板、門窗等場所，並增加通風量（內迴圈無用，盡量外迴圈）;

2）用核酸氣溶膠汙染清除劑（PCR清洗劑）對汙染區域的裝置進行反覆處理;對於包含空氣過濾系統的裝置，例如超潔淨工作台，更換過濾器; 核酸氣溶膠汙染清除劑用於用PCR清洗劑對移液器等受汙染裝置進行清潔和滅菌;

3）汙染區域及裝置裝置清潔完畢後，使用紫外線燈照射4小時以上;

4）可要求清潔工按照上述要求（1）、（2）、（3）連續三天進行清掃;

5）設計實驗對照組（根據汙染源基因片段），進行陰陽對照實驗，根據陰性對照確認汙染情況，使用連續8排PCR管（2個陽參+6個陰參）;如果陽參小心翼翼地跳，陰參跳，汙染需要清理; 如果陽參跳了，陰參根本沒有跳，說明汙染得到控制，可以恢復正常實驗;

核酸氣溶膠汙染清除劑（PCR清洗劑）盒裝500毫公升; 乙個 10 平方公尺的房間需要 2 個盒子才能完成封面; 其裝置和裝置是根據情況購買的;

大規模核酸氣溶膠汙染很難清除，如果不立即清理，汙染會更加固態，被汙染的核酸會長期釋放，導致實驗室關閉。

1）實驗室嚴格分割槽（包括製備區、提取區、擴增區、產品分析區劃分; 還包括DNA和RNA提取的分割槽），以及嚴格控制物流的方向。例如，每個猜測區域內的物品沒有交叉使用（包括白大褂、帽子、手套、板架、移液器、提取裝置、資料和提取試劑等）;

2）嚴格控制環境：盡量防止放大在工作過程中擴散;垃圾、塊莖等汙染物應及時清理; 用紫外線消除汙染物的長碎片; 實驗空隙通風，減少單位空間內汙染物; 實驗中嚴格控制層流; 實驗中使用了帽子和面具。

3）建立質量控制，實驗過程的正負控制是找到汙染源的好方法;

4）對試劑進行分裝，大包裝的試劑在使用前應分成小包裝;

5）使用UDG酶，可有效控制汙染物;

（六）其他有效措施。

新增陽性對照和陰性對照進行監視。

當然，預防是要小心......比如先離心再取樣的管子，我覺得目前的實驗條件不是那麼容易汙染的。

1。所有的工具包和器皿都是專用的。

2.計量在通風櫥中進行，以防止空氣中的氣溶膠汙染3移液器吸頭與過濾器一起使用，以防止移液器引起的交叉汙染4分析結果不應重新取樣，最好不要在房間內，以防止擴增產物受到汙染。