凝膠滲透柱層析有哪些應用？

凝膠滲透色譜法是一種根據溶質分子的大小分離溶質分子的色譜技術。 當不同溶質大小的樣品溶液通過凝膠柱時，由於凝膠顆粒內部網路結構的分子篩效應，不同分子大小的溶質會受到不同的延遲效應。 分子量大，不易滲透到網中，被排除在顆粒之外，因此阻斷效果小

凝膠顆粒 2分子 3小分子 4

大分子先流出層析床，小分子量可滲透到網中 圖1，凝膠滲透層析原理示意圖 內部洗脫過程長，所以延緩作用大，然後流出層析床，這樣就可以達到分離的目的。

凝膠色譜的關鍵是建立液固平衡，然後以適當的洗脫速率分離出不同的物質。 高溫有利於液固平衡的快速建立。 然而，高溫也會導致溶質在液體中擴散過快，導致分離效率降低。

目的是分離混合物，獲得一定數量的純組分，其中包括有機合成產物的純化、天然產物的分離純化。

1）作為分析工具：分子量差異較大的混合物可採用凝膠色譜法進行分析。在凝膠色譜法的基礎上，可以結合使用紙層析法或薄層色譜法來鑑定單個解離組分。

2）作為脫鹽工具：借助凝膠色譜技術可以去除聚合物溶液中的鹽雜質（如蛋白質核酸、多醣等），稱為脫鹽。癸烷凝膠SephadexG-25由於其流動阻力小和交聯適宜，常用於蛋白質溶液的脫鹽。

3）高分子溶液的濃度： （4）用於去除熱原物質：熱原物質是微生物產生的某些使人體面板湮滅的物質，如某些多醣蛋白複合物等，去離子水可用凝膠處理，得到適合製備注射劑的無熱原水。

5）為了測定高分子物質的分子量，將一系列已知分子量的標準樣品放入同一Burning Beat Gel色譜柱中，使其在相同條件下通過凝膠色譜分離，記錄各組分的洗脫體積，並用洗脫體積繪製分子量的對數， 在一定的分子量範圍內可以得到直線，這是分子量的標準曲線。（6）用於物質的分離和純化。

凝膠滲透色譜的原理如下：

凝膠色譜法，也稱為空間排阻色譜法。 由於凝膠的分子量不同，封閉效果不同，因此，它是一種通過使用一些凝膠來分離和分析混合物成分的方法。 凝膠色譜法的分離法與其他色譜法不同，它的功能類似於分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩大得多，一般為幾百到幾千埃。

該柱充滿具有一定大小孔隙的凝膠。 當樣品進入色譜柱時，不同大小的樣品分子隨流動相沿著凝膠顆粒的外部縫隙和凝膠的孔隙流動，體積中的分子被排除在外，因為它們不能滲透到凝膠孔中，因此它們相對平穩地通過凝膠柱，並較早地被流動相沖走。 中等體積的分子產生部分滲透。

小分子可以滲透到凝膠的孔隙中並受到延遲，並且由於平衡過程而稍後被洗出流動相。 這樣，試樣組分根據受阻分子的分子大小依次流出柱外，從而達到分離的目的。

光凝膠色譜法以水溶液為流動相，稱為過濾凝膠色譜法（HFC），而當使用有機溶劑作為流動相時，稱為凝膠滲透色譜法（GPC）。 GPC的分離基於體積排阻機制，其中充滿了多孔凝膠或顆粒，孔徑與待分離的聚合物分子相似，大體積的高餾分爐化合物無法進入凝膠孔。

它首先從凝膠顆粒中流出，浸出體積（時間）最小，聚合物根據其分子量按從大到小的順序浸出。 通過這種方式，通過製作已知分子量聚合物的標準曲線，可以分析要測試的未知同源性聚合物化合物。

脫鹽：聚合物溶液（如蛋白質、核酸、多醣等）溶液中的低分子量雜質可以通過凝膠色譜法去除，稱為海水淡化。 該方法的海水淡化操作簡單快捷，在海水淡化過程中蛋白質和酶不易變性。

合適的凝膠是Sephadexg或Bio-Gel-P。 柱長與徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25%-30%，為防止蛋白質脫鹽溶解後在柱上形成沉澱物吸附，層析柱一般用醋酸銨等揮發性鹽緩衝液平衡，然後加入樣品， 然後用相同的緩衝液洗脫，通過冷凍乾燥收集的洗脫液除去揮發性鹽。

用於分離純化：凝膠色譜法已廣泛用於酶、蛋白質、氨基酸、多醣、激素、生物鹼等物質的分離純化。 凝膠對熱原有很強的吸附力，可用於去除無離子水中的熱原，製備注射用水。

高分子物質分子量的測定：將一系列已知分子量的標準品置於同一凝膠柱中，在相同條件下進行色譜，記錄各組分的洗脫體積（已知分子量的標準品），用洗脫體積繪製分子量的對數，並用一條直線， 即分子量的標準曲線，可以在一定的分子量範圍內得到。在測定未知物質的分子量時，可以在具有測量標準曲線的凝膠柱上洗脫樣品，並且根據物質的洗脫體積可以在標準曲線上找到其分子量。

高分子溶液的濃度：通常將sephadexg-25或50乾膠放入稀聚合物溶液中，然後水和低分子量物質會進入凝膠顆粒內部的孔隙，將高分子物質排除在凝膠顆粒之外，然後離心或過濾分離膨脹的凝膠，得到濃縮的高分子溶液。

根據實驗目的選擇不同的凝膠型別。 如果實驗的目的是分離樣品中的大分子和小分子，由於它們在分配係數上存在顯著差異，這種分離也稱為基團分離，一般使用Sephadex G-25和G-50，而Sephadex G-10、G-15和Bio-Gel-P-2或4可用於小肽和低分子量物質（1000-5000）的脫鹽。 如果實驗的目的是分離樣品中某些分子量相近的物質，則這種分離也稱為分餾。

通常選擇排阻限略大於樣品中最高分子量物質的凝膠，這些物質在色譜過程中可以不同程度地滲透到凝膠中，最終由於KD的不同而被分離。 根據經驗，分組時，大部分採用長度為2-30cm的色譜柱，分餾分離時，一般要求長100cm左右的色譜柱，直徑為1-5cm，小於1cm產生壁效應，超過5cm為嚴重稀釋。 長度l與直徑d l d之比一般應在7-10之間，但對於緩慢移動的物質，應在30-40之間。

凝膠色譜法不僅可以用於分離和測定聚合物的相對分子量和相對分子質量分布，還可以根據所使用的凝膠填充劑分離脂溶性和水溶性物質，分離的相對分子質量可以從幾百萬到100以下不等。 近年來，凝膠色譜法也被廣泛用於小分子化合物。 分子量相近但化學結構不同的物質不能通過凝膠滲透色譜法完全分離純化。

凝膠色譜法無法區分分子大小相近的化合物，相對分子量差異需要大於10%才能分離。

（1）所有組分在溶劑分子洗脫前洗脫，分離時間短。

2）可洗脫時間，可連續進樣。

3）凝膠色譜法的分離過程不依賴分子間作用力，一般情況下，柱內沒有強殘留分子，因此分離時不會損失樣品成分，延長柱的使用壽命。

4）保留時間短，色譜峰窄，易於檢測。