PACYCDUET載體是否與PRT28B載體相容？

問專家：我現在正在做四個基因的共表達，使用雙表達載體 Pacycduet-1 和 Petduet-1，但活性沒有預期的那麼高。 我遇到了一系列問題，希望大家能提供寶貴的經驗和建議：

1） 如何誘導IPTG？我目前的方法如下：活化過夜，轉移100ml LB培養基，孵育至OD=，加入IPTG誘導的終濃度，在25度下誘導約5h。

超聲粉碎，得粗酶溶液，加入底物，孵育24小時。 這有問題嗎？ 有沒有人做過類似的實驗？

需要一些建議嗎？

2）我想要的蛋白質是細菌中的可溶性蛋白質，純化是不切實際的，因為我的酶需要四個基因。因此，請使用細菌破壞器。 我收集細菌，超聲波粉碎，功率為300w，超聲波3s，間隙3s，10-20分鐘。

這樣壓碎有問題嗎？ 一般的建議是，讓細菌變得透明就足夠了，但最好稍微透明，或者變得完全透明。 文獻中的透明度尚未得到理解???

我們希望您能提供寶貴的經驗和建議。

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轉殖蝦3樓 2012-12-06 11：30：35

至少進行電泳，看看你的四種蛋白質是否都表達出來。

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蘇智政二樓 2012-12-04 14：39：09

體外酶催化最不需要共表達，或者四個基因，經過單獨表達和純化後，再把酶放在一起催化？

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閆春秋七樓 2012-12-06 13：00：19

體外酶催化最不需要共表達，或者四個基因，經過單獨表達和純化後，再把酶放在一起催化？

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青亭哲9樓 2012-12-08 18：31：27

7樓： 引用自 Yan Chunqiu 在 2012-12-06 13：00：19

體外酶催化最不需要共表達，或者四個基因，經過單獨表達和純化後，再把酶放在一起催化？

底物是不能進入細胞的大分子物質，因此應用粗酶溶液破碎。 一些蛋白質在純化過程中是脆弱的和失活的，特別是當難以確保四種蛋白質同時具有活性時。 所以它不能被淨化！ 感謝您的參與。

相容，但首先嘗試培養菌株以防止基因突變。

重組質粒在多個轉殖位點插入外源DNA中，靶基因的上下游為酶切割位點，不包含起始碼和終止碼。 您設計的靶基因應包含酶切割位點、完整的蛋白質基因（包括起始碼和終止碼），最終靶基因應是夾在兩個切割位點之間的蛋白基因。

當然，要補充，負責如何形成環形結構。