標準化PCR實驗室應注意什麼

PCR證書的註冊流程如下：1.在臨床檢驗中心註冊。

2. 在指定地點參加考試。

3. 通過考試。

PCR核酸檢測。

報名資格：

1. 年滿 18 周歲。

2、遵守法律法規，恪守職業道德。

3、品行端正。

4、具備正常履行職責的身體條件。

5、有一定的生物學知識。

PCR證書的培訓課程包括：1.PCR的基本原理及相關檢測技術及進展。

2、臨床基因擴增和通檢測的質量保證。

3.臨床PCR標本的加工、模板製備和儲存。

4.螢光PCR結果分析及常見問題。

5.臨床基因擴增實驗室。

生物安全和防汙染措施。

6. PCR實驗室驗收中的問題和解決方案。

7.分子病理診斷中的PCR質量控制。

1.試劑儲存和製備區該實驗區的主要操作是儲存試劑的製備、試劑的分包裝和主反應混合物的製備。 用於標本製備的試劑和材料應直接運輸到該區域，不應通過其他區域。 試劑的原料必須儲存在區域內，並在區域內準備，以製成所需的儲存試劑。

對於氣壓的控制，該區沒有嚴格的要求。

2.標本製備區 該領域的主要操作是臨床標本的儲存、核酸（RNA、DNA）的提取、儲存和cDNA加入擴增反應管時的合成以及RNA的測定。 該區域的壓力梯度要求相對於相鄰區域為正，以避免氣溶膠從相鄰區域進入該區域。

汙染。 此外，應避免在點膠操作過程中由於水垢溶膠造成的汙染而在該區域進行不必要的移動。

3.擴增反應混合物的製備及擴增區 該區域的主要操作是DNA或cDNA擴增。 此外，還可以在該區域將製備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣品製備區）和主反應混合物的製備（來自試劑儲存和製備區）新增到反應混合物中。 巢中的PCR

在檢測中，第一輪擴增後必須開啟反應管，因此巢式擴增有很高的汙染風險，第二次進樣必須在區域性區域進行。 該區域的壓力梯度要求相對於相鄰區域為負，以避免氣溶膠從該區域洩漏。

為避免氣溶膠引起的汙染，應儘量減少該區域不必要的移動。 樣品進樣等個別操作應在潔淨室內進行。

4.擴增產物分析區的主要操作是擴增片段的檢測和靈敏度。 如果使用全自動密閉分析儀器，則可以省略該區域。 該區域是最重要的擴增產物汙染**，因此該區域對壓力梯度的要求是：

相對於相鄰區域施加負壓，以避免放大產物從該區域擴散到其他區域。

1.模板的材料主要以PCR增加物件為主，可以是病毒等病原體標本，也可以是細胞等病理生理標本。

2.標本處理的基本要求是去除雜質，對標本中的核酸進行部分純化。 大多數樣品用SDS和蛋白酶K處理。 難以破碎的細菌可以用溶菌酶加EDTA治療。

3.引物最好設計在模板cDNA的保守區，引物長度一般在15-30個鹼基之間，引物長度通常採用為18-27 bp，但不應大於38，因為太長會導致其伸長溫度大於74， 不適用於Taq DNA聚合酶反應。

4.引物的GC含量在40%-60%之間，TM值應接近72，GC含量過高或過低不利於引發反應。 上下游引物的TM值為寡核苷酸的熔解溫度，即50%的寡核苷酸雙鏈在一定鹽濃度下解凍的溫度。

5.引物的3'端應避免密碼子的第3位，引物的3端不應終止於密碼子的第3位，引物的第3端不能選擇A，最好選擇T，當引物的3端不匹配時， 不同鹼基的起爆效率差異很大。<>

PCR實驗：

1.DNA變性（90-96）：在熱作用下，雙鏈DNA模板的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2.退火（復性）（40-65）：體系溫度降低，引物與DNA模板結合形成區域性雙鏈。

3.延伸（68-75）：在Taq酶的作用下（最佳活性在72左右），以DNTP為原料，從引物的5端和3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。 每個迴圈都經過變性、退火和拉長，DNA含量增加一倍。